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酶免—電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)

一，酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)的原理

酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散是免疫電擴(kuò)散（Immunoelectrodiffusion,簡(jiǎn)稱IED）與免疫酶技術(shù)相結(jié)合的樣新技術(shù)，其原理在于通過免疫電擴(kuò)散，抗原與該抗原相應(yīng)的IgG快速形成免疫復(fù)合物，接著用酶標(biāo)記的抗IgG免疫球蛋白與免疫復(fù)合物孵育結(jié)合，然后用底物顯色。

酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散技術(shù)增加了免疫電擴(kuò)散的靈敏度，對(duì)分析復(fù)雜的抗原反應(yīng)和不同類型的免疫球蛋白，都有作用。

二，酶聯(lián)免疫電擴(kuò)散測(cè)定技術(shù)的程序

1，  器材與設(shè)備

電泳儀（包括電泳槽）；醋酸纖維薄膜（2.5cm×17cm）；微升吸管；大號(hào)培養(yǎng)皿等實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿。

2，  材料與試劑

可溶性抗原溶液；該抗原相應(yīng)的兔抗血清；HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體，其中特異性抗體蛋白的濃度為1.25mg/ml;0.1mol/LpH8.2巴比妥緩沖液；0.2%Haemosol溶液；0.1mol/L Ph7.6Tris緩沖液；0.01mol/LpH7.2 PBS;洗滌液（85gNaCI,500ml巴比妥緩沖液，蒸餾水加至1000ml）;底物與供氫體溶液（H2O2與DAB－4HC1）。

3，  實(shí)驗(yàn)程序

⑴在醋酸纖維薄膜上用軟鉛筆劃好點(diǎn)樣線，每條點(diǎn)樣線距離膜邊3cm，對(duì)距11cm,在每條點(diǎn)樣線中間用軟鉛筆劃好點(diǎn)樣點(diǎn)。

⑵在0.1mol/LpH8.2巴比妥緩沖液中浸濕，滴干水，但要保持濕潤(rùn)。

⑶用微升吸管點(diǎn)樣，一點(diǎn)加抗原3ul（或1ul）,另一點(diǎn)加兔抗待測(cè)抗原的血清15ul（或5ul）,每份點(diǎn)樣的抗原濃度為0.001－50ug.

⑷電泳條件。用濕濾紙搭橋，電泳緩沖液為0.1mol/L pH8.2巴比妥緩沖液，電流強(qiáng)度為1mA/cm,電泳時(shí)間為2h,抗原端接負(fù)極。

⑸電泳完畢，將薄膜浸入洗滌液30min，去多余的血清蛋白與游離抗原。

⑹將薄膜浸入0.01mol/L pH 7.2PBS中，振蕩洗滌30min,取出薄膜，滴干余水。

⑺將酶標(biāo)記抗體以1：50稀釋。

⑻用稀釋的酶標(biāo)記抗體在室溫孵育2h.

⑼在0.2%Haemosol溶液中振蕩洗滌15min.

⑽在Tris緩沖液中振蕩浸洗30min.

⑾在底物溶液中浸1min后，觀察顯色結(jié)果。